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    普朗醫(yī)療器械公司1月5日訊   血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子是在胚胎發(fā)生和創(chuàng)傷愈合過(guò)程中啟動(dòng)血管形成的一個(gè)高度特異的有絲分裂原，VEGF是胱氨酸生長(zhǎng)因子超家族的一員，主要由垂體中濾泡星形細(xì)胞產(chǎn)生，能誘導(dǎo)血管生成，其作用沒(méi)有種屬特異性。血管內(nèi)皮細(xì)胞可作為檢測(cè)VEGF促細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞。外周皮膚組織受損后數(shù)小時(shí)，即可在損傷局部檢測(cè)到VEGF mRNA和蛋白水平升高，由于血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)度增殖在許多種疾病的發(fā)病機(jī)制中可能具有重要作用，VEGF這種內(nèi)皮細(xì)胞高度特異性生長(zhǎng)因子，也因此而受到重視。實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀對(duì)標(biāo)本的收集與保存條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果有較大的影響，收集標(biāo)本前必須清楚要檢測(cè)的成分是否足夠穩(wěn)定。現(xiàn)就不同的標(biāo)本收集與保存條件做實(shí)驗(yàn)對(duì)照，加以觀察。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 試劑

        血管內(nèi)皮細(xì)胞檢測(cè)試劑盒由美國(guó)ADL（Adlitteram Diagnostic Laboratories,Inc）公司生產(chǎn)。

        1.1.2 儀器

        Opsys MR酶標(biāo)儀由深圳晶美生物工程有限公司(上海)生產(chǎn)；Opsys MW洗板機(jī)由深圳晶美生物工程有限公司(上海)生產(chǎn)；AMERICA 低溫冷柜武漢產(chǎn)；YANGZI低溫冰箱滁州產(chǎn)。

        1.2 方法

        1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理

        用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，向包被抗VEGF抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗VEGF抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的VEGF呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

        1.2.2 操作步驟

        按試劑說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間后應(yīng)盡快加入終止液，終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。

        1.2.3 檢測(cè)方法

        取新鮮待測(cè)標(biāo)本6份，分別檢測(cè)其血清中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子含量，并將每份標(biāo)本分別分成4份，使其中1份紅細(xì)胞破壞溶血，成為溶血標(biāo)本，檢測(cè)溶血標(biāo)本的VEGF含量。另3份分別置于2～8℃、-20℃、-70℃不同的保存環(huán)境中，于2 d、30 d，180 d分別檢測(cè)VEGF的含量，記錄OD值。

        1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件完成，兩樣本的比較采用t檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果

        通過(guò)觀察可見(jiàn)，標(biāo)本在2～8℃環(huán)境條件下可保存2 d，-20℃條件下可保存30 d，-70℃條件下可保存180 d。溶血標(biāo)本可使OD值顯著增高，出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此在標(biāo)本留取和保存過(guò)程中應(yīng)避免溶血（見(jiàn)表1）。表1 不同條件下VEGF檢驗(yàn)結(jié)果比較（略）

        3 討論

        研究表明，VEGF在動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育中起著極其重要的作用［1,4］。VEGF的主要作用在于調(diào)節(jié)血管發(fā)生和血管形成，這主要體現(xiàn)在VEGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的促進(jìn)分裂增生和趨化作用。除此之外，VEGF對(duì)單核細(xì)胞也有趨化作用。目前研究認(rèn)為［2］，血管發(fā)生過(guò)程對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起著至關(guān)重要的作用。由于VEGF這種血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長(zhǎng)因子在血管發(fā)生中起著重要的調(diào)節(jié)作用，因此，VEGF受體與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移也存在著密切的關(guān)系。腫瘤組織內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF受體明顯高于正常內(nèi)皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體的表達(dá)可作為患者預(yù)后的指標(biāo)之一［3］。在急性心肌梗死患者，血清VEGF明顯增高，比心絞痛和陳舊性心肌梗死者明顯增高，表明血清VEGF濃度可反映心血管缺血程度［5］。此外，在一些血管發(fā)生異常過(guò)度的疾病，如糖尿病性視網(wǎng)膜病變及其他增生性視網(wǎng)膜病變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、接觸性皮炎等病變組織局部也可檢測(cè)到VEGF和VEGF受體mRNA水平升高。鑒于此，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子檢測(cè)越來(lái)越受到臨床對(duì)疾病診療的重視，實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本的收集與保存條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果有較大的影響，收集標(biāo)本前必須清楚要檢測(cè)的成分是否穩(wěn)定。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，標(biāo)本在2～8℃環(huán)境條件下可保存2 d，-20℃條件下可保存30 d，-70℃條件下可保存180 d，溶血標(biāo)本可使OD值顯著增高，出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此在標(biāo)本留取和保存過(guò)程中應(yīng)避免造成溶血。對(duì)收集后當(dāng)天進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)本，可儲(chǔ)存在4℃備用，如有特殊原因需要周期收集標(biāo)本，將標(biāo)本及時(shí)分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存，且應(yīng)避免反復(fù)凍融，以期取得較好的檢測(cè)結(jié)果。