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    結合血清學診斷技術的發展和展望
    加入時間:2011-12-15 09:45:54  當前新聞點擊率:4759

        普朗醫療器械公司科技——結核病的細菌學檢查目前是結核病實驗室診斷的金標準。通過血液細胞分析儀研究,由于痰涂片陽性率較低,鏡檢需要經驗,難以區分環境分枝桿菌造成的假陽性;痰培養需時太長,因此細菌學檢查對結核病的診斷價值有限。隨著分子生物學技術的迅速發展,用高度敏感的方法檢測結核菌及其特異性DNA片段,如PCR、生物探針和基因芯片等,需要相應的檢測設備和檢測費用高未能廣泛推廣。血清學診斷技術有其固有的優勢,如操作簡便、快速、便于推廣、無需特殊精密血液分析儀器,已有多種純化的特異性抗原可采用,可以發展成自動化檢測,尤其是對痰培養陰性和肺外結核病有較為重要的輔助診斷價值,受到廣泛的重視。本文從靶抗原的選擇和檢測技術的改進等方面綜述了結核病血清學診斷的現狀和進展。

        血清學診斷技術的發展

        在結核病血清學診斷過程中發現單一抗原無法產生令人滿意的診斷結果,多克隆抗原“雞尾酒”的應用,有助于血清學診斷特異性和敏感性的提高。 ELISA方法簡便易行,快速又無需特殊精密儀器,在結核病血清學診斷方面研究最多,應用最廣并在技術上進行了多方面的改進。另外,免疫印跡技術、蛋白芯片技術等檢測血清抗體方法,為結核病的診斷提供了有價值的手段。

        1.聯合應用結核抗原 將結核特異性的抗原聯合或者幾種特異蛋白融合成多聚蛋白復合物用于檢測能提高診斷能力,不影響診斷特異性,而比單一抗原法具有更高的敏感性。Okuda等回顧性地分析了三種結核病血清學診斷抗原TBGL、LAM、A60在活動性肺結核中的應用,其敏感性分別為70.1%、67.5%、70.9%,特異性分別為92.5%、97.5%、95.0%。三種抗原聯合檢測其敏感性提高到91.5%,特異性降為87.5%。Houghton等報道用病人的血清從結核分枝桿菌基因組表達文庫中鑒定出Mtbll(即CFP-10)、Mtb8、Mtb48和DPEP(富含脯氨酸的蛋白),并得到各自的重組蛋白。通過血液細胞分析儀檢測,將 Mtbl1、Mtb8與38kDa蛋白的編碼基因重組構建經大腸埃希菌表達為多表位的蛋白聚合體TbF10,在此基礎上,又加入Mtb48構建成蛋白聚合體TbF6,兩者用于診斷,比單一抗原法的靈敏度都有所提高,再加入DPEP則能顯著提高檢測的靈敏度。多抗原“雞尾酒”診斷方法有利于節約生產和檢測成本,如進一步優化抗原組合,可以在發展中國家推廣使用。

        2.循環免疫復合物(CIC)測定 特異性循環免疫復合物的檢測是結核病血清學診斷中的另一重要領域。活動性結核病人特異性IgG類免疫復合物明顯增加,并隨病情的好轉而下降,故檢測血清、腦脊液、胸腹水中的結核特異性免疫復合物對活動性結核的診斷也有重要的意義。經血液分析儀研究,部分活動性肺結核病人痰菌檢查陽性,而血清結核抗體測定為陰性,其原因之一就是形成CIC所致。因此,眾多的研究者認為檢測結核病人CIC含量有助于結核病的輔助診斷。檢測CIC最簡便的方法為酶標法。CIC-ELISA特異性比痰涂片要高,尤其對不易得到痰標本的兒童結核和肺外結核效果較好。

        3.免疫印跡技術 免疫印跡技術是高分辨的SDS-PAGE技術與高敏感性的酶聯反應技術的結合產物。目前,該技術已被轉化成產品,操作者只要通過后半步驟的酶聯免疫反應,即可檢出待檢標本中所含的多種結核分枝桿菌多肽抗原成分的特異性抗體。北京生產的TB-40結核抗體免疫印跡法檢測試劑盒選取的抗原來自于結核分枝桿菌全菌,并篩選出最具免疫原性及特異性高的蛋白成份做為診斷抗原,大幅度提高了診斷準確性,并可做為結核病診斷的確證實驗。用于檢測痰菌陽性結核患者、痰菌陰性結核患者、肺外結核病的敏感性分別為93%、86%、89%,特異性超過95%。

        4.酶聯免疫斑點(ELISpot)技術 ELISpot技術是檢測細胞分泌細胞因子的一種實驗方法,采用可定量的夾心ELISA方法,通過ELISpot酶聯斑點分析系統對加底物后形成的斑點分析后得出結果。ELISpot具有較高的特異性和敏感性,目前正被國內外廣泛應用。英國Ewer等用ELISpot檢測對結核分枝桿菌分泌的抗原有特異性反應的T淋巴細胞來診斷早期結核病。經過血細胞分析儀研究,這項研究共納入了結核流行區有不同程度結核病接觸史的535名學生,結果顯示結核菌素皮膚試驗(TST)和 ELISpot的一致性達89%(P<0.0001)。但ELISpot與研究對象結核病接觸程度之間的正相關性顯著強于TST。在接種過BCG的兒童中,TST假陽性的可能性較大,而BCG接種對ELISpot結果沒有影響。作者認為ELISpot可開始替代TST,這將使更多的人能在感染仍處于隱匿期時就可進行預防,而不至于發展成為嚴重的結核病。

        5.蛋白芯片技術 蛋白芯片技術借助于高通量蛋白檢測技術平臺,將結核分枝桿菌多種抗原固相于同一微孔濾膜并利用微孔濾膜的滲濾、濃縮、凝集作用,使抗原抗體反應在固相膜上快速進行,然后以免疫金作為標記物直接在膜上顯色。再以蛋白芯片閱讀儀自動掃描膜上顏色,建立多種結核抗原的蛋白芯片檢測系統。該檢測系統具有以下優點: 操作簡便、快速,病人血清分離出來后,只需5分鐘就可以為臨床提供有價值的實驗資料;敏感性高,特異性強,符合臨床輔助診斷要求;結果的判斷采用芯片識別閱讀儀,避免了人為判讀時的主觀誤差。

        6.體液中結核抗原或抗體的檢測 結核抗體檢測技術已日趨成熟,測定的標本除血清外還有腦脊液、胸腹水、痰、灌洗液和尿液等。Singh等聯合檢測尿液和血清中抗體診斷結核病有很高的靈敏度,為進一步研究檢測尿液中的抗體診斷結核病打下了基礎。由于機體受到結核分枝桿菌感染后,體內首先出現的是結核抗原,而結核抗體則要感染后8周起逐漸產生,因此檢測結核抗原具有早期診斷價值。尤其對結核性腦膜炎的快速診斷、對器官移植術后并發結核感染的確定和對肺結核與肺癌的鑒別診斷等尤為重要。目前,有關結核抗原檢測的研究國內外均有報道,其中尤以腦脊液結核抗原檢測的研究較多。Song等用抗結核分枝桿菌過氧化氫酶-過氧化物酶(mKatG)單克隆抗體,采用蛋白印跡技術來檢測病人組織中的mKatG抗原,其敏感性為55%,特異性為100%。痰標本中的結核抗原檢測也有報道,但技術問題較多,因為痰是不均勻的粘膠樣半流性液體,很難準確測定。

        展望

        現有結核病的診斷方法并未能滿足臨床需要,未來結核病診斷試劑的發展更加強調簡單、價廉、快速、敏感而且特異,且對特定的人群要有特定的檢測診斷方法。目前我們應加強下述內容的研究:①發現更多的特異性抗原聯合用于檢測:由于結核分枝桿菌抗原結構復雜,分枝桿菌屬中各種細菌之間抗原性存在廣泛的交叉,因此應結合分枝桿菌基因組學和比較基因組學的成果,著重于結核分枝桿菌特異性抗原的分析和純化;②加強血細胞分析儀測定方法的研究,進一步提高檢測方法的敏感性和特異性:要對方法的最佳測定條件、可能的影響因素等進行細致研究;要通過大量標本的測定結果比較,選擇最佳測定方法,并使之在基層推廣應用;要研究定量測定,盡可能用儀器判斷結果,以避免人為測定誤差;③加強對特定的人群如痰涂片陰性病人、合并HIV感染者、老年患者或隱性感染者、肺外結核病和兒童結核病等特定的檢測診斷方法的研究;④加強對除痰外的多種體液檢測的研究,如尿液,容易收集且無創,特異,是未來結核病血清學診斷的方向。

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