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基因測序技術與原理
加入時間：2014-03-03 16:27:00 當前新聞點擊率：2703
基因是指攜帶有遺傳信息的DNA或RNA序列，也稱為遺傳因子，是控制性狀的基本遺傳單位?；蛲ㄟ^指導蛋白質的合成來表達自己所攜帶的遺傳信息，從而控制生物個體的性狀表現。基因有控制遺傳性狀和活性調節的功能?；蛲ㄟ^復制把遺傳信息傳遞給下一代，并通過控制酶的合成來控制代謝過程，從而控制生物的個體性狀表現?；蜻€可以通過控制結構蛋白的成分，直接控制生物性狀。因此對生物從分子生物學水平上進行研究，在醫學上對某種遺傳疾病的研究等都離不開對DNA或RNA的序列進行測定。
基因測序也是生物學研究的重要手段，目前應用的兩種基因測序技術分別為雙脫氧鏈終止法及化學降解法。南京普東興從事基因測序研究的業內專家介紹，其原理大相徑庭，但這兩種方法都是同樣生成互相獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個堿基出現在可變終止端的機會均等，因些上述每一組產物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。然后在可以區分長度僅差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中若干個相鄰的泳道這上，即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。
一、雙脫氧鏈終止法：現行的鏈終止法由加減法序列測定技術發展而來的。加減法首次引入了使用特異引物在DNA聚合酶作用下進行延伸反應、堿基特異性的鏈終止，以及采用聚丙烯酰胺凝膠區分長度差一個核苷酸的單鏈DAN等3種方法。盡管有了這些進展，但加減法仍然太不精確，也太不得法，因此難以廣為接受。直至引入雙氧核苷三磷酸（ddTBP）作為鏈終止劑，酶法DNA序列測定技術才得到廣泛應用。ddNTP與普通dNTP不同之處在同它們在脫氧核糖的位置缺少一個羥基。它們可以在DNA聚合酶作用下通過其三磷酸基團摻入到正在增長的DNA鏈中，但由于沒有羥基，它們不能同后續的dNTP形成磷酸二酯鏈，因此，正在增長的DNA鏈不可能繼續延伸。這樣，在DNA合成反應混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP后， 鏈延伸將與偶然發生但卻十分特異的鏈終止展開競爭，反應產物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現過早鏈終止的位置之間的距離。在4組獨立的酶反應中分別采用4種不同的ddNTP，結果將產生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。
二、化學降解法：化學降解法與包括合成反應的鏈終止法不同，需要對原DNA進行化學降解。其基本原理是，首先對待測DNA末端進行放射性標記，再通過5組（也可以是4組）相互獨立的化學反應分別得到部分降解產物，其中每一組反應特異性地針對某一種或某一類堿基進行切割。因此，產生5組（或4組）不同長度的放射性標記的DNA片段，每組中的每個片段都有放射性標記的共同起點，但長度取決于該組反應針對的堿基在原樣品DNA分子上的位置。此后各組反應物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，通過放射自顯影檢測末端標記的分子，并直接讀取待測DNA片段的核苷酸序列。 上一篇:
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