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    醫(yī)療器械網(wǎng):熒光定量PCR檢測技術(shù)無需內(nèi)標(biāo)
    加入時間:2012-02-15 10:11:29  當(dāng)前新聞點(diǎn)擊率:5018

        醫(yī)療器械網(wǎng)稱 PCR檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)療研究機(jī)構(gòu)和生物技術(shù)研究領(lǐng)域,那么,PCR檢測技術(shù)有哪些特點(diǎn)和技術(shù)要求呢?

        PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(英文全稱:Polymerase Chain Reaction)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期,通過酶標(biāo)儀循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時等特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究,還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR)又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。

    1.實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)
    實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,并記錄在軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計(jì)算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。
    1)Ct值的重現(xiàn)性:PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性極好,即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。
    2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系:由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,因此,實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)本同步進(jìn)行核酸提取的曲線定量方法。
    2.內(nèi)標(biāo)對實(shí)時熒光定量PCR的影響
    若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo),則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR,雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭,尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時,這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的,所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。正因如此,定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo),仍為一種半定量方法。
    美國Texas大學(xué)的酶標(biāo)儀科研人員進(jìn)行了外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較,得出的結(jié)論是:內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的,而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。
    Applied Biosystems公司的7700型實(shí)時熒光定量PCR儀是全球公認(rèn)的熒光定量PCR的金標(biāo)準(zhǔn),可實(shí)現(xiàn)多色熒光同時檢測,但定量檢測仍然采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法,而不用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。

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