醫療器械網：熒光定量PCR檢測技術無需內標
加入時間：2012-02-15 10:11:29 當前新聞點擊率：5054
醫療器械網稱 PCR檢測技術已經廣泛應用于醫療研究機構和生物技術研究領域，那么，PCR檢測技術有哪些特點和技術要求呢？
PCR即聚合酶鏈式反應（英文全稱：Polymerase Chain Reaction）。聚合酶鏈式反應（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，通過酶標儀循環進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。
1.實時熒光定量PCR無需內標
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。
1）Ct值的重現性：PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關系：由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準與標本同步進行核酸提取的曲線定量方法。
2．內標對實時熒光定量PCR的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。正因如此，定量方法雖然加入內標，仍為一種半定量方法。
美國Texas大學的酶標儀科研人員進行了外標法定量和內標法定量的方法學比較，得出的結論是：內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方法。
Applied Biosystems公司的7700型實時熒光定量PCR儀是全球公認的熒光定量PCR的金標準，可實現多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標準曲線的方法，而不用內標進行定量。
